Monoklonalne przeciwciało stymulujące tarczycę 6

Zwierzęta uśmiercono i w oddzielnych eksperymentach komórki śledziony poddano fuzji z mysimi komórkami SP-02 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA). Fuzje hybrydoma przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (24). W skrócie, komórki poddane fuzji utrzymywano w selektywnej pożywce Dulbecco ze zmodyfikowanym Iscove. (Invitrogen Corp.) zawierającej 10% FCS i suplementy (gentamycyna, L-glutamina, pirogronian sodu i hipoksantyna / aminopteryna / tymidyna). Około 2 tygodnie po fuzji zebrano supernatanty i badano przesiewowo za pomocą cytometru przepływowego przy użyciu komórek CHO-hTSHR (patrz poniżej). Pozytywne klony ponownie testowano i tylko supernatanty testujące pozytywnie dalej reklonowano przez ograniczające rozcieńczenie w celu otrzymania pojedynczego klonu. Stężenie monoklonalnego przeciwciała IgG chomika, MS-1 i TAb-4, TAb-6, TAb-8 i TAb-16 w supernatantach hybrydoma oznaczano za pomocą testu ELISA wychwytującego IgG. Płytki do mikromiareczkowania (Immulon 1, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, Virginia, USA) powleczono .g / studzienkę oczyszczonej IgG przeciw chomiczce (Roche Molecular Biochemicals) w buforze węglanowym / wodorowęglanowym, pH 9,6, przez noc w 4 ° C. . Przeciwciało monoklonalne chomika o znanym stężeniu, oczyszczone na kolumnie białka A z pożywki hodowlanej pozbawionej surowicy (Cell MAb Medium, BD Biosciences, Sparks, Maryland, USA), zastosowano do wytworzenia standardowej krzywej od 10 ng / ml do 100. g / ml. Pięćdziesiąt mikrolitrów supernatantu hybrydom dodano w dwóch powtórzeniach. Uszkodzone IgG chomika sondowano anty-armeńskim chomikiem IgG skoniugowanym z biotyną (1: 250, BD Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA), a następnie streptawidynową fosfatazą alkaliczną (1: 500, Sigma-Aldrich). Nieznane stężenie IgG obliczono ze standardowej krzywej otrzymanej przez kontrolne przeciwciało monoklonalne. Wykrywanie TSHR-Ab za pomocą cytometrii przepływowej. W celu oznaczenia TSHR-Ab w supernatantach hybrydomy komórki CHO-hTSHR oderwano przy użyciu mM EDTA / EGTA / PBS (Sigma-Aldrich) i ponownie zawieszono w PBS zawierającym 0,1% BSA plus 0,01% azydek sodu (bufor FACS). Zawiesinę tę rozdzielono na okrągłodenne 96-studzienkowe płytki w ilości 2×105 komórek / studzienkę. Do każdej studzienki dodano dwadzieścia pięć mikrolitrów supernatantów hybrydomy i mieszano. Po godzinie inkubacji w temperaturze 4 ° C komórki przemyto i 50 ul buforu FACS zawierającego 1: 100 anty-armeńskiego chomika IgG (który reaguje z IgGl <3) (BD Pharmingen) inkubowano przez 60 minut w 4 ° C. C w ciemności. Intensywność fluorescencji mierzono za pomocą cytometru przepływowego FACScan (BD Pharmingen). Pozytywne klony ponownie testowano przy użyciu CHO-hTSHR i kontrolnych komórek CHO stosując ten sam protokół. Tylko stabilne, specyficzne klony wykazywały silniejsze barwienie komórkami CHO-hTSHR niż komórkami CHO i oceniono je jako pozytywne i poddano ograniczającemu rozcieńczeniu. Po zbadaniu surowicy chomika surowicę rozcieńczono 1: 100 buforem FACS i inkubowano z komórkami CHO-hTSHR lub CHO. Jako przeciwciała drugorzędowe stosowano IgG2 przeciw Igrzyskom antymiańskim i IgG3 skoniugowane z FITC i IgG1 anty-armeńskie IgG1 skoniugowane z biotyną (BD Pharmingen). Ze skoniugowanym ze streptawidyną fikoerytryną (1: 100, Sigma-Aldrich) zastosowano dwukolorowe barwienie w celu oznaczenia izotypu IgG TSHR-AB. Wykrywanie TSHR-Ab przez test konkurencji. Komórki CHO-TSHR (5 x 104) wysiano na 96-studzienkowe płytki dzień przed testem. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Następnego dnia komórki zostały przemyte zmodyfikowanymi Hankami. roztwór (5,4 mM KCl, 1,31 mM CaCl22H2O, 0,8 mM MgSO447H2O, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM KH2P04, 33,5 mM HEPES, g / l dekstrozy i 0,2% BSA). Komórki następnie inkubowano z 50 ul zmodyfikowanych Hanków. roztwór zawierający wzrastające dawki bydlęcego TSH (aktywność właściwa, 2,0 IU / mg, Sigma-Aldrich) do generowania krzywej standardowej lub 50 ul supernatantu lub 50 ul surowicy 1:10 plus 50 ul 125I- znakowane TSH (Kronus Inc., Boise, Idaho, USA) zawierające 10 000 cpm / studzienkę w 37 ° C przez 2 godziny [więcej w: jak zrobić chłopakowi dobrze ustami, parafrenia, ksobne ]

Tags: , ,

Comments are closed.

Powiązane tematy z artykułem: jak zrobić chłopakowi dobrze ustami ksobne parafrenia