Monoklonalne przeciwciało stymulujące tarczycę 4

Trzy startery przednie (5aCATAGGCGCCTTGAATAGCCCCCTCCACCAGGAA-3a, 5a-CATACCCGGGCAGGAGCTCAAAAACCCCCAGGAA-3 (3 i 5a -GAAGACATAATGGGCTACAAGTTCCTGAGA-3a) z dodatkowymi miejscami dla enzymów restrykcyjnych zastosowano do wygenerowania TSHR. podjednostki rozpoczynające się resztami 316, 366 i 409. Produkty o ograniczonym dostępie ligowano w ramce do 3. koniec cDNA peptydu sygnałowego TSHR wytworzonego przez hybrydyzację oligonukleotydów peptydu sygnałowego do przodu i do tyłu. Sekwencje weryfikowano przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Każda skrócona TSHR. podjednostkę klonowano następnie do pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA). Do klonowania, zatrzymać kodony na 3. koniec wstawki pominięto i zmodyfikowane wstawki poddano ligacji w ramce do końca aminowego GFP. Wszystkie te komórki były podobnie barwione przeciwciałami monoklonalnymi, a immunoreaktywność badano za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku analizy Western blot preparaty błon komórkowych wytworzone z wykorzystaniem digitoniny z komórek CHO-hTSHR (28) i białka ektodomeny TSHR (TSHR-289) (13) (dostarczone osobiście przez B. Rapoport) rozdzielono za pomocą SDS-PAGE w warunkach redukujących (za pomocą 2. % a-merkaptoetanol) i przeniesiono na membranę PVDF (Pall Corp., Ann Arbor, Michigan, USA). Supernatant hybrydoma (rozcieńczenie 1: 5) zastosowano jako pierwszorzędowe przeciwciało. Jako przeciwciało drugorzędowe stosowano przeciwciało IgG skoniugowane z peroksydazą chrzanową (BD Pharmingen). Cięcie TSHR określone za pomocą cytometrii przepływowej. W celu ilościowego oznaczenia cięcia TSHR zastosowano dwa monoklonalne przeciwciała TSHR. RSR-4 rozpoznaje reszty 322. 341, epitop w insercji 50 aminokwasów (4), którego brakuje w pociętej TSHR. RSR-1 rozpoznaje epitop na N-końcu. podjednostka TSHR. RSR-1 i RSR-4 (29) zostały dostarczone przez B. Reesa Smitha (RSRLtd., Cardiff, Wielka Brytania). Komórki CHO-hTSHR zaszczepiono przy 0,8 x 106 komórek na studzienkę w sześcio-studzienkowych płytkach z 10% pożywką do hodowli komórek zawierającą surowicę w obecności różnych dawek TSH bydlęcej (całkowita objętość 2 ml) i inkubowano przez 24 godziny w 37 ° C . Po dwukrotnym przemyciu w PBS i odłączeniu komórki CHO-hTSHR podzielono na porcje i wybarwiono powyższymi przeciwciałami RSR (1 .g / próbkę). Jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano anty-mysie IgG skoniugowane z fikoerytryną (1: 100, Sigma-Aldrich). Analiza statystyczna. Test t Studenta wykorzystano do analizy statystycznej. P <0,05 uznano za znaczący. Wyniki Szczepienia. Spośród dziesięciu chomików immunizowanych wektorem adenowirusowym wybrano dwa do fuzji hybrydoma. Autoimmunologiczne profile poziomów tyroksyny i TSHR-Ab z tych dwóch zwierząt przedstawiono w Tabeli 1. Surowice zawierały głównie IgG2 i IgG3 TSHR-Ab, co określono za pomocą cytometrii przepływowej, co sugeruje, że te zwierzęta z nadczynnością tarczycy miały głównie odpowiedź immunologiczną Th1 (30 ). TSHR-Ab w surowicy wykrytej w teście kompetycyjnym wykazało ponad 90% blokowanie wyznakowanego wiązania TSH. Obecność stymulującej TSHR-Ab była również wykrywalna w tych surowicach, jedna surowica stymulowała zarówno ludzkie, jak i mysie komórki CHO wyrażające TSHR, a jedna surowica stymulowała tylko mysią TSHR (Tabela 1). Próbki tarczycowe tych dwóch zwierząt wykazały przerost komórek tarczycy związany z występowaniem brodawek (nie pokazano). Tabela Profile autoimmunologiczne dwóch chomików Armenii stosowanych do fuzji hybrydoma Badanie przesiewowe i izolacja monoklonalnego TSHR-Ab. Łącznie, 1920 studzienek badano przesiewowo za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu komórek CHO-hTSHR i wybrano 39 dodatnich supernatantów. Te pozytywne supernatanty ponownie testowano w celu wyeliminowania niestabilnych klonów. Siedem z 39 supernatantów było stabilnie dodatnich, a następnie ponownie zreklonowano przez ograniczone rozcieńczenie w celu otrzymania pojedynczych klonów. Spośród tych siedmiu dostępnych było pięć monoklonalnych przeciwciał TSHR-Ab do dalszej analizy (tabela 2). Izotyp IgG tych siedmiu przeciwciał monoklonalnych stanowił IgG2, co odzwierciedla izotyp IgG w surowicy zwierząt z nadczynnością tarczycy. Tabela 2 Charakterystyka monoklonalnego TSHR-Ab Funkcjonalny test monoklonalnej TSHR-Ab [patrz też: kaufland łódź godziny otwarcia, ksobne, fizjoterapia uroginekologiczna ]

Tags: , ,

Comments are closed.

Powiązane tematy z artykułem: fizjoterapia uroginekologiczna kaufland łódź godziny otwarcia ksobne